Utilisation du vivant : Des sources multiples au service de la pharmacie

Le 01 janvier 2015 par AURÉLIE DUREUIL ET SYLVIE LATIEULE
* Mots clés : 

Le vivant est depuis toujours une source d'inspiration pour l'industrie pharmaceutique à la recherche de nouvelles molécules thérapeutiques. De plus en plus d'espèces végétales et animales, qu'elles soient terrestres ou marines, sont désormais utilisées comme des bioréacteurs pour produire des molécules d'intérêt.

Si l'essentiel des principes actifs pharmaceutiques sont produits par voie chimique au fin fond d'usines indiennes ou chinoises, le recours à la nature redevient d'actualité. L'une des raisons est que le monde végétal, fongique, microbien, ou animal, qu'il soit terrestre ou marin, recèle des centaines de milliers de molécules qui peuvent présenter des propriétés pharmacologiques particulièrement intéressantes. Or cette biodiversité est d'autant plus précieuse que la chimie combinatoire, inventée dans les années 90, n'a pas tenu ses promesses pour la découverte massive de nouvelles molécules thérapeutiques.

Jusqu'à présent, c'est surtout le monde végétal terrestre qui a apporté une forte contribution en matière de principes actifs pharmaceutiques. « L'homme étant un organisme terrestre, il a surtout co-évolué avec les plantes. Comme il avait besoin de se nourrir, par un processus d'essais et d'erreurs, il a été amené à identifier des végétaux toxiques, mais qui, selon la dose administrée, pouvaient aussi les guérir », explique Stéphane la Barre, un ancien de la Station biologique de Roscoff (CNRS), consultant en écologie marine. Des savoirs existent encore en médecine traditionnelle et c'est tout l'objet de l'ethnopharmacologie que d'essayer de les recenser.

L'investigation du milieu marin est en revanche plus récente et date des années 50. Les cibles ont d'abord été ces molécules toxiques sécrétées par des plantes, des animaux fixés ou à déplacement lent qui doivent attaquer ou se défendre pour subsister. Depuis une dizaine d'années, les scientifiques s'intéressent aussi aux bactéries maritimes qui sont en général associées à des organismes vivants, mais également aux sédiments du fond des mers. Des propriétés antibactériennes, antifongiques, antibiotiques ou anticancéreuses sont alors recherchées.

 

Les progrès de la génomique

 

Outre l'extraction ou la synthèse totale pour les molécules, grâce aux progrès réalisés dans le domaine de la génomique, les scientifiques investiguent une autre voie, celle de la reprogrammation du vivant pour produire à façon les molécules thérapeutiques de leur choix. Cette approche est d'autant plus importante que les candidats médicaments développés dans les laboratoires pharmaceutiques sont de plus en plus souvent des biomolécules aux architectures complexes, comme des peptides ou des protéines, que l'on ne sait plus fabriquer par voie chimique classique. C'est là que les laboratoires pharmaceutiques font appel à des animaux, qui deviennent alors des bioréacteurs vivants, ou à des cellules, ce qui a permis l'essor de la bioproduction. Le LFB, par exemple, produit une antithrombine recombinante dans le lait de chèvre. Genzyme utilise des lapins pour la production de Thymoglobuline (voir encadré). Du côté des cellules, « il existe une multitude de sources de cellules. Les lignées CHO (ndlr ovaire de hamster chinois) ou HEK (ndlr cellules rénales embryonnaires humaines) ont été développées, il y a de nombreuses années, pour la production de protéines recombinantes et sont maintenant partie intégrante des collections mondiales, comme celles de l'ATCC (voir encadré). Il existe également une multitude de lignées cellulaires pour différentes applications. Pour le développement d'anticorps monoclonaux, par exemple, nous utilisons des myélomes murins (des cellules cancéreuses) fusionnés avec des lymphocytes B de souris pour produire des hybridomes » détaille Jean-Luc Schlick, responsable export de RD-Biotech.

La nature inspire, mais elle est aussi capable de produire. Et alors que le changement climatique sera l'objet de Paris Climat 2015, Stéphane La Barre fait le lien entre la biodiversité et la protection de notre santé : « Avec l'effondrement d'écosystèmes complets, on pourrait assister à la perte de trésors moléculaires ». Un argument de plus pour se soucier de la préservation de notre planète.

LE RÈGNE VÉGÉTALLa pervenche de Madagascar pionnière en oncologie

La médecine par les plantes ou phytothérapie existe depuis la nuit des temps et, jusqu'au milieu du XXe siècle, les plantes représentaient encore l'essentiel de la pharmacopée européenne. Avec l'avènement de la chimie moderne, cette suprématie s'est perdue. Pour autant, les chercheurs des laboratoires Pierre Fabre sont restés convaincus que les plantes recensées, et celles restant à découvrir, recélaient potentiellement des molécules particulièrement intéressantes pour les secteurs de la santé et de la beauté. Grâce à la pervenche de Madagascar et des alcaloïdes qu'elle contient, la société a été l'une des pionnières pour développer des alcaloïdes anticancéreux de deuxième et troisième générations. L'histoire de la pervenche tropicale a débuté dans les années 1950's au Canada par la recherche d'une éventuelle activité antidiabétique. Mais cette pervenche inactive dans le domaine du diabète a finalement prouvé sa capacité à freiner la multiplication des globules blancs carac-téristiques des leucémies, explique Bruno David, responsable Sourcing et Botanique Pôle Actifs végétaux à l'Institut de recherche Pierre Fabre. Cette faculté a été attribuée à deux alcaloïdes, la vincristine et la vinblastine, présentes en très faible quantité dans le végétal. C'était sans compter sur l'inventivité du chimiste Pierre Potier et de son équipe du CNRS à Gif-sur-Yvette qui sont parvenus à réaliser ces molécules par hémisynthèse, à partir de deux précurseurs présents en quantité plus élevée dans la plante. En marge de ces travaux, ils ont synthétisé en 1977 une molécule non naturelle, la vinorelbine (Navelbine), active sur les cancers solides (cancers du sein, du poumon...), poursuit Bruno David. Ultérieurement en 1991, une fluoration en milieu superacide a permis d'accéder à la vinflumine (Javlor), l'anticancéreux le plus actif de toute cette famille. Les plantes constituent donc de formidables sources de principes actifs ou d'intermédiaires avancés permettant l'économie de longues étapes de synthèse. Par ailleurs, les laboratoires Pierre Fabre disposent pour leur recherche d'une bibliothèque de molécules unique au monde grâce à une collection de quelque 15000 échantillons de plantes. Mais aujourd'hui, une nouvelle étape est en train d'être franchie avec des sociétés qui commencent à travailler sur une reprogrammation des plantes pour les orienter vers la production de substances chimiques à façon.

S.L.

LE RÈGNE VÉGÉTALProduire à façon grâce aux plantes

C'est ainsi que la CRO française, Plant Advanced Technology, développe un procédé de production de protéines recombinantes à partir de plantes carnivores appelées Drosera et Nepenthès. Jean-Paul Fèvre, président de la société, explique que ces plantes sécrètent naturellement une glue constituée de sucre et de protéines pour leur permettre de digérer les insectes qui tombent dans leur piège. La société s'est donc attelée à la modification du génome de ces espèces pour que soit désormais sécrétée la molécule d'intérêt qui est récupérée par simple écoulement sans destruction de la plante. « Notre premier brevet date de 2006 et nous l'avons étendu mondialement. Cependant, la technologie a été très longue à développer ; en particulier, la transformation génétique. Mais nous avons aujourd'hui des résultats très intéressants et nous espérons être opérationnels dans les deux ans avec cette voie alternative de production de protéines recombinantes », ajoute le dirigeant. Selon lui, la technologie présente de nombreux avantages. Le scale-up est aisé car il ne s'appuie que sur du bouturage. L'étape de down stream processing est moins onéreuse car le liquide secrété par les plantes ne contient que quelques protéines à séparer. Enfin, par rapport à l'usage de cellules animales, les plantes offrent une meilleure sécurité sanitaire avec l'absence de prion ou de virus. Outre cette technologie, Plant Advanced Technology s'était fait connaître pour son procédé « plante à traire » qui consiste à stimuler des plantes pour accroître la production d'une molécule d'intérêt se trouvant au niveau de leurs racines. Les racines sont ensuite lavées pour en extraire le principe actif et les plantes remises en culture. Cette technologie n'a pour l'heure que des applications en cosmétique, notamment pour la production d'un antioxydant ou 1 000 m2 de serre remplacent 30 ha de culture. À terme, Plant Advanced Technology espère pouvoir proposer cette technologie de production à la pharmacie.

S.L.

LE RÈGNE VÉGÉTALDes vaccins innovants issus de plants de tabac

Au Canada, le laboratoire pharmaceutique Medicago va encore plus loin. Il développe de nouveaux vaccins à partir de plantes en remplacement des technologies qui passent par l'utilisation d'oeufs ou de cultures cellulaires. La technologie de l'entreprise consiste à utiliser une plante indigène australienne apparentée au tabac dans laquelle la société insère le matériel qu'elle veut faire exprimer de façon transitoire, explique Nathalie Charland, directrice senior de la liaison scientifique. Dans la pratique, les plantes sont plongées dans un bain de solution contenant le matériel génétique que l'on souhaite transférer. Un vide est appliqué pour évacuer tout l'air contenu dans les feuilles. Le vide est ensuite brisé et les plantes vont alors se comporter comme des éponges et absorber le liquide contenant les vecteurs qui transfèreront le matériel génétique nécessaire à l'expression de la protéine d'intérêt (vaccin, anticorps, enzyme, etc.). En sortant de ce traitement, les feuilles ont un aspect « mouillé », mais elles vont très vite retrouver leur aspect initial et seront remises en chambre de culture pour 7 à 10 jours d'incubation durant lesquels la machinerie cellulaire de la plante exprimera la protéine. Pour l'extraire, la plante entière est récoltée. Medicago utilise alors une technologie maison à base d'enzymes qui consiste à digérer la partie végétale de la plante. La protéine est ensuite récupérée par simple centrifugation puis purifiée pour obtenir un principe actif en vrac. Dès l'infiltration, toutes les étapes de fabrication sont réalisées dans des conditions GMP, la plante faisant office de bioréacteur. « Nous développons actuellement un vaccin saisonnier quadrivalent contre la grippe. Il entrera cette année en phase IIb. Nous espérons commencer la phase III en 2016 pour une mise sur le marché en 2019. Nous avons aussi dans notre pipeline un vaccin contre le rotavirus et un vaccin contre le VPH qui sont tous les deux en phase préclinique », poursuit Nathalie Charland soulignant que cette technologie pourrait permettre à terme de produire des anticorps ou des biosimilaires.

S.L.

LE RÈGNE ANIMALL'oeuf, bioréacteur du vaccin contre la grippe

Cela fait plusieurs décennies que les oeufs de poule embryonnés sont utilisés pour la production de vaccins. D'ailleurs, le groupe Sanofi Pasteur utilise cette technologie, parfaitement maîtrisée, depuis 1973 à Val de Reuil, notamment pour la production de vaccins contre la grippe saisonnière, dont il est le numéro un mondial. De ce site sortent chaque année, 130 millions (80 HN et 50 HS) de doses pour les besoins des populations dans l'hémisphère Nord et Sud. Et cette performance est bien à mettre à l'actif de la machinerie cellulaire des oeufs qui joue le rôle de bioréacteur. Philippe Ivanès, directeur du site de Val de Reuil explique que le site reçoit chaque jour 560 000 oeufs de poule embryonnés à 11 jours de qualité spécifique. Ces oeufs sont inoculés successivement avec 3 souches de virus qui constituent le vaccin. Ils sont ensuite placés quelques jours à incuber à 35 °C pour permettre la réplication virale. Une fois cette étape achevée, les oeufs sont placés une nuit dans une chambre à 5 °C. La récolte peut alors commencer. Pour cela, le haut de l'oeuf est décoquillé. On recueille son liquide allantoïque contenant le virus mêlé à des protéines d'oeuf. Par une série d'étapes de purification, le virus est isolé, le principe actif du vaccin étant les antigènes qui sont fixés sur la surface du virus. , C'est pourquoi les étapes suivantes consistent en la fragmentation en petits morceaux du virus pour libérer ses antigènes qui sont ensuite purifiés, concentrés et filtrés. « Onze jours s'écoulent entre l'arrivée des oeufs et l'obtention du produit final en vrac. Pour produire un vaccin, il faut encore ajouter les étapes de formulation, de répartition et de conditionnement, ainsi que toutes les étapes de contrôle. De façon générale, pour des produits biologiques, les contrôles peuvent représenter jusqu'à 80 % des temps de production », commente Dominique Coquard, directeur de la production vrac à Val-de-Reuil.

S.L.

LE RÈGNE ANIMALDes lapins pour la production de Thymoglobuline

« Dans le domaine de la lutte contre le rejet de greffe, notre procédé très spécifique de production de Thymoglobine fait toute son efficacité. Les médicaments concurrents produits par culture cellulaire ont un spectre d'actions moins important », affirme Stéphane Piquand, directeur des sites industriels Genzyme Polyclonals de Lyon. Commercialisé en France depuis 1984, Thymoglobuline est un immunosuppresseur utilisé dans la greffe d'organe solide et en hématologie. En 2013, 850 000 flacons ont été produits par les deux sites français (Lyon-Gerland et Marcy-L'Étoile). Sa fabrication repose sur l'utilisation du vivant et plus particulièrement de lapins. La première étape consiste à collecter des thymus, un tissu provenant d'opérations cardiaques chez l'humain. Une fois reçu par les équipes de Genzyme à Lyon, ce tissu fait l'objet d'une extraction de cellules spécifiques. Ce sont ces cellules qui sont envoyées dans les animaleries partenaires dans toutes l'Europe. « Elles sont injectées aux lapins dans les 24 heures qui suivent l'extraction et en étant conservées à 5 °C. Il faut ensuite un temps pour la génération des anticorps par l'organisme du lapin, puis nous collectons le sang à plusieurs reprises. Dans nos locaux lyonnais, nous extrayons les immunoglobulines du sérum ainsi obtenu », précise Stéphane Piquand. Les lapins permettent ainsi de produire les protéines d'intérêt. Mais l'utilisation d'organismes vivants impose des contraintes. « L'hygiène, la diffusion de musique, etc. font partie d'un environnement propice au bien-être des animaux, indispensable à la production du sérum », indique Stéphane Piquand. La filiale de Sanofi développe des accords avec les animaleries partenaires pour avoir des bâtiments dédiés à cette production. « Les partenaires sont des établissements spécialisés qui font l'objet d'autorisations par les autorités dans le cadre d'une réglementation très exigeante. Le fait d'avoir des bâtiments dédiés nous permet d'être fortement impliqués dans leur gestion et notamment dans le monitoring environnemental », témoigne Yao Koffi, médecin vétérinaire du site Genzyme Polyclonals. L'utilisation d'animaux implique de nombreuses contraintes. Dans ce cadre Sanofi applique une charte 3R (remplacement, raffinement, et réduction). « Le premier point vise à éviter l'utilisation d'animaux, quand c'est possible. Le deuxième point concerne l'amélioration des conditions d'hébergement des animaux. Nous travaillons continuellement sur ce point avec nos partenaires. Enfin, la réduction consiste à diminuer le nombre d'animaux utilisés. Pour Thymoglobuline, nous avons diminué par deux le nombre de flacons nécessaires pour traiter un patient depuis le début de la commercialisation », souligne Yao Koffi. Stéphane Piquand précise : « Nous avons optimisé notre procédé de purification du sérum de lapin, ce qui permet d'avoir besoin de quantités de sérums moins importantes. Par ailleurs, au niveau de la délivrance par les médecins, un meilleur monitoring permet d'adapter le dosage au strict nécessaire pour le patient ». Si l'utilisation du vivant semble ainsi indispensable pour certains procédés, l'optimisation des méthodes se poursuit pour réduire l'impact de ces process.

A.D.

LE MILIEU MARINDes molécules marines sources d'inspiration

À Roscoff en Bretagne, la start-up Manros Therapeutics, créée en 2007, s'inspire du milieu marin, et en particulier, d'une éponge du Pacifique Sud, la Leucetta, pour développer de petites molécules chimiques qui se comportent comme des inhibiteurs de protéines kinases qu'elle reproduit ensuite par voie chimique. « Nous avons synthétisé plus de 500 molécules dérivées de ce produit naturel. Il nous faut à présent opérer une sélection parmi elles et achever de l'optimiser pour aboutir, à terme, au candidat-médicament », expliquait récemment Laurent Meijer, directeur de recherches, détaché du CNRS, et cofondateur et dirigeant de ManRos Therapeutics. Ces molécules sont susceptibles de fournir des candidats-médicaments dans des domaines larges : traitement de cancers, maladies neurodégénératives comme Alzheimer ou maladies rénales (polykystose rénale). Fin 2013, la société de biotechnologie a obtenu la labellisation du Pôle Mer Bretagne et du Pôle Santé Alsace Biovalley pour son programme TRIAD qui a pour objectif de caractériser un candidat-médicament sélectif de l'inhibition de la protéine kinase DYRK1A pour lutter contre la trisomie 21 et la maladie d'Alzheimer. Plus avancé dans ses développements, le groupe pharmaceutique espagnol Pharmamar (groupe Zeltia) poursuit une même stratégie. Depuis sa création en 1986, il s'est constitué une bibliothèque de 135 000 espèces marines. Celle-ci lui a permis d'isoler 700 molécules réparties en 30 familles chimiques. Certaines de ses molécules ont déjà atteint la mise sur le marché comme Yondelis (trabectédine), indiqué en cancérologie dans le sarcome des tissus mous évolués. Cette substance, de la famille des alcaloïdes tetrahydroisoquinoléiques, a été découverte dans un tunicier (organisme marin entouré d'une tunique), retrouvé dans les racines de mangroves. Mais pas question d'exploiter ce tétard. La production de la molécule par voie chimique dans l'outil industriel de Pharmamar en Espagne.

S.L.

LE MILIEU MARINUne hémoglobine universelle tirée d'un ver arénicole

Dernier exemple de l'utilisation du milieu marin avec la société Hemarina, basée à Morlaix, qui développe un transporteur d'oxygène universel. C'est un petit ver marin, l'annélidé Arenicola marina qui vit dans le sable et mesure plusieurs dizaines de centimètres, qui est à l'origine de cette molécule et de la société. Son habitat, l'estran, est situé entre les niveaux de pleines mers de vives eaux et le niveau moyen des basses mers. Pour cela, il dispose d'un système circulatoire qui constitue une réserve à oxygène entre la marée haute et la marée basse. Franck Zal, expert reconnu mondialement dans le domaine de l'hémoglobine des invertébrés marins et leur transport d'oxygène, a eu l'idée d'exploiter cette particularité. « Notre découverte va notamment permettre d'augmenter la durée de vie et la qualité des greffons en attente de transplantation, de répondre à des situations d'urgence lors de transfusions sanguines ou de développer des pansements permettant d'accélérer la vitesse de cicatrisation des plaies », explique-t-il. « Il manque 100 millions de litres de sang par an dans le monde pour satisfaire à l'ensemble des besoins de transfusion ». En revanche, pas question de procéder à la synthèse totale de cette hémoglobine. Mieux vaut utiliser ce ver. Hemarina a donc acquis, en 2013, la Ferme Marine de Noirmoutier pour élever ses propres vers, espérant produire entre vingt et trente tonnes de vers marins, chaque année, alors que la société est aujourd'hui contrainte de se fournir à l'étranger. Élevés, récoltés, congelés, les vers sont envoyés au LFB Biomanufacturing qui en extrait et en purifie l'hémoglobine selon un process appartenant à Hemarina.

S.L.

ENTRETIEN avec Mindy Goldsborough, vice-présidente et directrice générale d'ATCC Cell Systems détaille le fonctionnement de l'organisation.L'organisme américain ATCC fournit les lignées cellulaires

Industrie Pharma : Pouvez-vous présenter ATCC ? Mindy Goldsborough : ATCC est la première organisation mondiale de ressources de matériaux biologiques et de standards (Manassas, Virginie). Ensemble, les collaborateurs d'ATCC partagent la mission d'acquérir, authentifier, préserver, développer, standardiser et distribuer des matériaux biologiques et l'information pour l'avancement et l'application de la connaissance scientifique. Nous constituons la collection la plus grande et la plus diversifiée au niveau mondial de lignées cellulaires humaines et animales ainsi que de micro-organismes et dérivés de ces matériaux biologiques, comme les acides nucléiques et les protéines. Tous les produits biologiques sont fabriqués sous la certification ISO 9001:2008. Nous comptons plus de 400 employés et nos produits sont distribués dans plus de 140 pays en direct et par nos partenaires mondiaux dans 12 pays. Qui sont vos clients ? M.G. : Les entreprises pharmaceutiques sont nos principaux clients. Nous sommes les premiers fournisseurs mondiaux pour l'industrie pharmaceutique, les biotechnologies, la recherche académique et les laboratoires d'États. Nos produits servent pour les recherches de base mais aussi en production. Beaucoup de nos produits sont ainsi utilisés pour la fabrication de médicaments. De l'identification à la production de grosses molécules en passant par les tests de toxicologie. Il peuvent utiliser de nombreuses lignées cellulaires au cours du temps. Comment est constituée votre banque de cellules ? M.G. : Notre collection a débuté en 1925 en réponse au besoin de préserver les micro-organismes isolés ou utilisés dans les expérimentations de recherche. Cela a été étendu depuis aux lignées cellulaires. La collection d'ATCC inclut une large gamme de cellules, avec plus de 3 400 lignées cellulaires continues, des lignées cellulaires induisant des cellules souches pluripotentes humaines, et d'autres cellules pluripotentes, etc. Toutes ces cellules peuvent être utilisées comme modèle in vitro pour des applications allant de la recherche au drug development en passant par les études de toxicité. Notre site principal est à Manassas (Virginie). Il accueille la bioproduction, la recherche et développement, le développement de standards, les services techniques et marketing ainsi que les opérations corporate. Nous avons aussi un site de R&D à Gaithersburg (Maryland). Les produits d'ATCC sont disponibles au niveau mondial. LGC distribue nos produits à travers l'Europe et possède un bureau à Molsheim en France. Quels sont les axes de développement de cette banque de lignées cellulaires ? M.G. : Notre site de R&D est concentré sur le développement de nouvelles lignées cellulaires et les applications. Historiquement, pour la communauté scientifique, nous avons comme objectif de développer des lignées cellulaires standard. Avec les nouvelles technologies, nous devons être la norme pour les clients pour l'utilisation de lignées cellulaires pour le screening toxicologique. Nous améliorons également les modèles in vitro, pour les recherches sur les voies cellulaires, la bio-informatique... Pour l'industrie pharmaceutique, pour la recherche, ils veulent des modèles pour constituer un pipeline plus efficace et opérationnel.

Propos recueillis par Aurélie Dureuil


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Article extrait d'Industrie Pharma Magazine

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