Plongée au coeur de l'expression des cellules

Le 20 mars 2017 par NICOLAS VIUDEZ

Une équipe française est parvenue à analyser de façon globale les ARN d'une seule cellule. Un procédé qui permet de mieux comprendre son fonctionnement et son évolution dans le temps.

L'équipe de Pascal Barbry, directeur de l'Institut de pharmacologie moléculaire et cellulaire (IPMC) de Nice, a mis au point une technique fiable d'analyse parallélisée des ARN produits par chaque cellule dans un groupe d'une centaine de cellules. Ces travaux, publiés en décembre 2016 dans la revue Nucleic Acids Research, ouvrent la voie à une meilleure compréhension du destin cellulaire. « Le séquençage des ARN permet d'avoir un instantané de l'état cellulaire, on peut savoir les spécificités d'une cellule et documenter son état : est-elle, par exemple, en train de se diviser ou de mourir par apoptose ? », résume Pascal Barbry.

 

Amplifier l'ARN de manière fiable

 

Les ARN, transcrits à partir de l'ADN, ne représentent que quelques picogrammes dans une cellule. Le challenge était donc de parvenir à amplifier le signal pour parvenir à quantifier correctement les niveaux d'expression de tous les gènes, tout en évitant les biais produits par une amplification trop importante. « Avec l'amplification d'aussi petits échantillons, on risque toujours d'obtenir des biais importants, tous les gènes n'étant pas forcément amplifiés de façon homogène ! Nos travaux avaient pour objectif de fiabiliser ce procédé », souligne le directeur de recherche au CNRS. La méthode d'analyse conçue par cette équipe niçoise s'appuie sur des techniques développées depuis le début des années 2000, notamment pour le séquençage de l'ADN. « Nous avons tout d'abord utilisé des techniques microfluidiques et plus particulièrement un procédé, le système C1, développé par la société Fluidigm. Cette technique permet d'isoler les cellules que l'on souhaite analyser », précise Pascal Barbry. Avec ce procédé micro-fluidique, un ensemble de cellules est injecté dans une puce composée d'un canal principal et d'une série de canaux secondaires. Jusqu'à 96 cellules distinctes peuvent être isolées par le dispositif utilisé par les chercheurs. Au coeur de la puce, les cellules sont transférées dans des chambres réactionnelles de quelques nanolitres dans lesquelles sont réalisées les synthèses biochimiques des banques à partir desquelles sont analysés les contenus des cellules en ARN. C'est là que le procédé développé se différencie des techniques traditionnelles, comme le détaille le responsable de cette étude : « Au moment de récupérer les ARN d'une cellule et avant de lancer la PCR (Amplification en chaîne par polymérase, ndlr), nous marquons les séquences avec une séquence aléatoire de quelques nucléotides, qui va agir comme un code-barres ». Une technique qui permet de suivre la séquence initiale au travers des nombreux cycles de PCR qui vont permettre d'amplifier le matériel de départ. « L'objectif est finalement de compter pour chaque transcrit le nombre des différents codes-barres qui sont associés dans chaque cellule à un transcrit particulier. C'est cette information qui va donner une idée de l'abondance de l'ARN dans cette cellule. Cette mesure est effectuée en parallèle pour tous les transcrits présents. On augmente ainsi la qualité et la fiabilité de la mesure », ajoute Pascal Barbry.

 

Comprendre les mécanismes d'évolution de la cellule

 

À l'avenir, cette technique devrait être améliorée pour permettre l'analyse d'un nombre encore plus important de cellules. « Nous travaillons avec d'autres approches que le système C1 pour pouvoir analyser des milliers de cellules en parallèle et disposer d'un échantillon qui est statistiquement très significatif », souligne Pascal Barbry. À la clef, c'est une meilleure compréhension des mécanismes en jeu dans le devenir de la cellule qui se dessine. « On peut suivre dans le temps une culture cellulaire et voir alors quelles cellules vont se différencier, et quelles sont les diverses étapes intermédiaires qui participent à ce mécanisme de différentiation », poursuit-il. « D'autres applications extrêmement prometteuses sont en cours de développement pour traduire une banque de séquences dans une culture cellulaire, afin d'éteindre spécifiquement un gène par cellule et observer alors son influence sur la cellule. Il suffit pour cela de mesurer les variations d'expression des ARN qui y sont transcrits. Une telle approche peut permettre d'accélérer considérablement le phénotypage de systèmes complexes ». Des applications dans la recherche médicale sont également en vue, basées sur cette technique d'analyse à l'échelle d'une cellule. « Nous travaillons en partenariat avec d'autres équipes de la région niçoise qui utilisent notre approche pour des recherches dans le domaine du cancer. D'ailleurs, notre travail est soutenu par le Cancéropole PACA », signale Pascal Barbry avant de conclure : « On peut ainsi imaginer, si l'échantillon est assez important et représentatif, pouvoir observer quelle cellule va subir une mutation, voire évoluer vers un stade cancéreux. Comme il s'agit d'événements rares au niveau cellulaire, il faut par contre disposer au départ d'un nombre de cellules suffisamment important ».


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